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枳实总黄酮对5-氟尿嘧啶诱导的肠黏膜炎小鼠肠道菌群失调的影响

发布时间:2022-07-16 08:43:04来源:火狐下载 作者:火狐体育苹果app


  ,观察小鼠体质量、饮食量、饮水量、腹泻评分、胸腺指数、脾脏指数、结肠形态、隐窝深度;采用苏木素与模型组相比,枳实总黄酮组小鼠体质量和饮食量增加,饮水量减少,腹泻评分降低,胸腺指数和脾脏指数显著增加基因测序结果显示,模型组小鼠肠道菌群多样性和丰度降低,枳实总黄酮组小鼠肠道菌群多样性和丰度增加。门水平主要表现为厚壁菌门相对丰度升高;属水平上拟杆菌属

  5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是一种抗代谢药物,为治疗恶性肿瘤最常用的处方药之一[1]。由于5-FU对DNA合成抑制的作用是非靶向性的,它不仅攻击肿瘤细胞,还攻击正常细胞,导致增殖抑制、DNA损伤和细胞死亡,引起广泛的不良反应[2-3]。其中最严重的不良反应之一为肠黏膜炎并伴有严重腹泻[4-5]。研究表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)[6]、炎性细胞因子[7-8]、细胞凋亡[9]以及肠道菌群失调是导致肠黏膜炎的主要因素[10-11]。50~80%接受5-FU治疗的患者发展为肠黏膜炎或伴有严重腹泻的黏膜炎[12-13]。目前治疗肠黏膜炎和肠黏膜炎腹泻的药物大多是以对症和短期治疗为原则[14-15]。因此,开发安全有效的药物对治疗5-FU诱导的肠黏膜炎有重要意义。

  枳实是酸橙Citrus aurantium L.及其栽培品种或甜橙C. sinensis Osbeck的干燥幼果,长期以来作为中药单味或入制剂治疗腹泻、胃胀胀痛和子宫脱垂等胃肠道疾病[16]。黄酮类、生物碱、挥发油和香豆素是枳实的主要活性成分[17-18]。枳实中的挥发油成分具有抗线]和抗乙酰胆碱酯酶活性[21];辛弗林和N -甲基酪胺等生物碱类成分通常作为食品补充剂,可以减轻体质量并改善体态[22];黄酮类成分中的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷具有抗氧化[23]、抗癌[24]、抗炎[25]、保护胃黏膜[26]、抗凝、调节肠道运动[27]、保护神经[28]等作用。然而,枳实黄酮类成分对化疗诱导的肠黏膜炎的作用及机制少有报道。本研究从枳实中制备得到总黄酮,探究其对5-FU诱导的肠黏膜炎小鼠的影响。1材料

  QVSW-20A型超纯水仪(美国Millipore公司);RE-52A型旋转蒸发仪(上海荣生化工仪器厂);HHW-21CU-600B型恒温水浴锅(上海福玛实验设备有限公司);YP6000N型电子天平(上海精密仪器科技有限公司);WK1000A型高速多功能粉碎机(山东青州市精诚机械有限公司);TDL-5A型台式低速大容量离心机(上海菲恰尔分析仪器);ELX808型酶标分析仪(美国基因有限公司);DY89型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司);SIM-FI40AY65型制冰机(日本松下电器);OMYSS-325型全自动高压灭菌锅(日本TOMY公司);低温微量高速离心机(重庆市医疗器械有限公司);超净工作台(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)。2方法

  枳实总黄酮由本课题组采用低共熔溶剂(氯化胆碱/醋酸)进行超声波辅助提取,利用大孔吸附树脂富集分离技术对溶液中黄酮类成分富集分离,采用HPLC

  、分组与给药小鼠适应性饲养1周后随机分为对照组、模型组以及枳实总黄酮低、中、高剂量(50

  100、200 mg/kg)组和洛哌丁胺(0.3 mg/kg)组,每组10只。对照组ip 0.9%氯化钠溶液,其余各组ip 5-FU(50 mg/kg)5 d诱导肠黏膜炎模型;从第6天开始,各给药组ig相应药物,对照组和模型组ig 0.9%氯化钠溶液,1次/d,连续7 d。自造模第1天起,每天记录各组小鼠体质量、饮食量、饮水量、大便形状及临床表现,并对腹泻状态进行腹泻评分,评分≥1的小鼠被认为是腹泻,表现为自主活动减少、肛周污染、体质量减轻、粪便湿软或呈水样,评分为0表明小鼠大便正常,自主活动和体质量增加。2.3胸腺和脾脏指数的测定

  ip 3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉,采血后脱颈椎处死小鼠,紧靠心脏处取下胸腺,胃后面取下脾脏,滤纸吸去血迹,分别称定质量。无菌条件下收集结肠中粪便并测量结肠长度,计算胸腺和脾脏指数。胸腺(脾脏

  4 μm切片,进行苏木素-伊红(HE)染色,于光学显微镜下观察肠黏膜病理变化,评估结肠的病理变化,同时测量隐窝深度。2.5ELISA

  如图1所示,对照组小鼠活动敏捷,体质量增加,饮食饮水正常,毛发光滑,无腹泻情况。模型组小鼠出现腹泻、扎堆、懒动、体质量减轻、饮食减少、饮水增加、翻毛和肛周污渍症状。各给药组小鼠体质量和饮食增加、饮水减少,第12

  组腹泻评分接近正常,表明腹泻基本好转。第12天除模型组外,其余各组小鼠粪便基本正常,进一步说明枳实总黄酮明显改善了5-FU诱导的小鼠腹泻。3.2

  0.01);与模型组比较,枳实总黄酮中、高剂量组和洛哌丁胺组小鼠胸腺和脾脏指数显著增加(P<0.05、0.01),表明枳实总黄酮可以使肠黏膜炎小鼠胸腺和脾脏指数恢复至正常水平。3.3

  P<0.01);与模型组相比,各给药组结肠长度显著增加(P<0.05、0.01)。如图3-C

  P<0.01),各给药组隐窝深度明显恢复(P<0.01),表明枳实总黄酮可以恢复肠黏膜炎小鼠结肠长度,增加隐窝深度。如图3-D所示,对照组小鼠基本没有出现炎性细胞浸润情况,隐窝结构保持完整且排列规则;模型组小鼠结肠组织中,上皮细胞坏死,隐窝结构被破坏,大量炎性细胞浸润到黏膜层;与模型组相比,各给药组肠上皮细胞、隐窝的形状和分布得以恢复,表明枳实总黄酮可以修复5-FU诱导的结肠黏膜损伤,减轻肠道炎症反应。3.4

  IL-6和IL-1β水平显著增加(P<0.01);与模型组相比,各给药组结肠组织中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著降低(P<0.05、0.01),表明枳实总黄酮能够调节肠黏膜炎小鼠结肠组织中炎症因子水平。3.5

  、GSH-Px活性和MDA水平的影响如图5所示,与对照组相比,各造模组小鼠结肠组织中SOD

  GSH-Px活性显著降低(P<0.01),MDA水平显著增加(P<0.01);与模型组比较,洛哌丁胺组结肠组织中GSH-Px活性显著升高(P<0.01),MDA水平显著降低(P<0.01);枳实总黄酮各剂量组结肠组织中SOD和GSH-Px活性显著升高(P<0.05、0.01),MDA水平显著降低(P<0.01),表明枳实总黄酮可以改善肠黏膜炎小鼠的氧化应激参数。3.6

  77 099条,各组之间的DNA序列无显著差异。分析表明,尽管通过更高的测序覆盖率可以获得新的系统,但每个样品中的肠道菌群多样性大都可以在当前测序深度下得到充分捕获(图6-B)。Illumina Hiseg测序系统产生了929个可操作分类单位,相似度截止为97%。组间OTU重叠表明,6组共有455个相同的OTU,对照组、模型组、洛哌丁胺组以及枳实总黄酮低、中、高剂量组分别有14、11、28、18、9、4个独立的OUT(图6-C)。与对照组相比,模型组OTU数量略有减少;与模型组相比,枳实总黄酮中剂量组OUT数量明显增加,枳实总黄酮低、高剂量组对OUT数量没有产生影响(图6-D)。OUT数据表明,通过枳实总黄酮中剂量可以恢复肠道菌群的多样性。为了阐明不同群体之间微生物群结构变化,进行β

  NMDS。如图6-E所示,PC1和PC2变化的百分比分别为18.85%和12.46%,模型组与其他5组样本相距较远,枳实总黄酮各剂量组较洛哌丁胺组更接近对照组,NMDS分析也观察到同样的结果(图6-F)。如图6-G~J所示,与对照组比较,模型组小鼠Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数显著降低(P<0.05);与模型组比较,枳实总黄酮中剂量组Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数显著升高(P<0.05),洛哌丁胺组Chao1、ACE、Simpson和Shannon指数显著降低(P<0.05)。综上,5-FU通过减少微生物群落丰富度和多样性改变了肠道菌群的整体结构,枳实总黄酮中剂量有效地恢复了肠道菌群的整体结构,洛哌丁胺使肠道微生物的丰富性和多样性的降低,使得肠道菌群的整体结构进一步恶化。

  如图7所示,在门水平上,拟杆菌门、厚壁菌门和变形杆菌门是各组的主要菌门。拟杆菌门、厚壁菌门、变形杆菌门、unidentified_Bacteria

  和1.00%,占总丰度的99.38%。与对照组比较,模型组拟杆菌门和变形杆菌门分别增加至65.70%和3.67%,厚壁菌门和放线%;洛哌丁胺组及枳实总黄酮低、中剂量组厚壁菌门相对丰度分别恢复到31.70%、29.54%、37.86%。与对照组比较,模型组厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)显著降低(P<0.01);与模型组比较,洛哌丁胺组及枳实总黄酮低、中剂量组F/B显著升高(P<0.05、0.01)。如图8所示,在属水平上,对照组拟杆菌属Bacteroides、拟普雷沃菌属Alloprevotella

  ;枳实总黄酮可以恢复肠黏膜炎小鼠的结肠长度,改善隐窝萎缩,抑制炎症因子水平,表明枳实总黄酮对结肠形态和黏膜具有保护作用;枳实总黄酮能够通过改善胸腺指数和脾脏指数恢复了肠黏膜炎小鼠受损的免疫功能。综上所述,枳实总黄酮可有效减轻5-FU引起的肠道不良反应,与文献报道一致[30-31]

  ROS、DNA、蛋白质和细胞膜相互作用以调节信号通路,通过产生促炎细胞因子导致组织破坏和炎症反应。5-FU通过抑制内源性抗氧化剂(如SOD、过氧化氢酶、GSH、GSH-Px)活性及升高MDA和促炎细胞因子(包括TNF-α

  IL-1β、IL-6)水平,诱导肠黏膜炎[32]。本研究发现,小鼠给予5-FU后,结肠组织中SOD和GSH-Px活性降低,MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高;枳实总黄酮能够提高SOD和GSH-Px活性,抑制MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。因此,枳实总黄酮能够通过抗氧化和抗炎来治疗5-FU诱导的肠黏膜炎。5-FU干扰肠道微生物群落。通过16S rDNA扩增测序技术分析了各组小鼠粪便样本中的微生物群。结果表明,5-FU造模后小鼠肠道菌群的丰富度和多样性显著降低,从而肠道菌群的整体结构发生改变;枳实总黄酮中剂量组通过增加丰富度和多样性将肠道微生物群的整体结构调节到正常水平。在门水平上,模型组小鼠肠道厚壁菌门相对丰度降低,拟杆菌门和变形杆菌门相对丰度增加,F/B

  F/B。由于厚壁菌和变形杆菌是粪便相关菌,而拟杆菌被认为是黏膜相关菌,它们的丰度变化最有可能引发细菌感染和胃肠道疾病如腹泻和肠炎[33]。F/B是评估肠易激综合征[34]

  [35]和代谢紊乱[36]等肠病患者的常用指标。在属水平上,模型组小鼠肠道拟杆菌属、unidentified_ Clostridiales和Romboutsia相对丰度显著增加,而拟普雷沃菌属、乳酸杆菌属、Alistipes和unidentified_ Ruminococcaceae相对丰度显著降低。拟杆菌是与5-FU治疗相关的重要病原菌之一,一些梭状芽孢杆菌如肉毒梭菌,由于产生外毒素而被认为是致病菌。益生菌乳杆菌可以改善5-FU引起的肠道损伤和生态失调

  。瘤胃球菌通过产生丁酸盐为肠上皮细胞提供必需的能量,以提高肠道免疫力[38]。枳实总黄酮能够抑制潜在致病菌并促进了粪便中的益生菌,从而改善5-FU诱导的肠道微生物群失调。枳实总黄酮的黏膜保护作用、枳实总黄酮中活性成分与肠道微生物群之间的具体关系仍待进一步确定。一是粪便群落不能完全代表生活在肠道中的细菌群落[39];二是当枳实总黄酮调节肠道微生物群的整体结构时,其黏膜保护作用和成分可能会受到肠道微生物代谢和药动学的影响[40]。例如,在枳实总黄酮中分别占15.45%、39.19%的柚皮苷和橙皮苷对人体肠道微生物群(半乳糖拟杆菌、乳酸杆菌、肠球菌、链状双歧杆菌、布氏瘤胃球菌、大肠杆菌)没有表现出体外抑制活性,但苷元缺表现出体外抑制活性

  。因此,枳实总黄酮活性成分和肠道微生物群变异之间关系的系统和全面解释将是本课题组后续研究的重点。综上所述,枳实总黄酮可以通过抑制氧化应激、抑制促炎细胞因子分泌并调节肠道微生物群的整体结构和组成,有效减轻5-FU诱导的肠黏膜炎。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献(略)返回搜狐,查看更多

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